“ 新生抗原 ”与癌症免疫治疗

作者：癌图腾

导读

过去十年， 癌症疗法迅速发展，免疫治疗已经成为仅次于手术、化疗和放疗的一种成熟的癌症治疗方法。利用免疫系统杀死癌细胞的免疫疗法已经在许多人类恶性肿瘤中显示出良好的治疗效果。肿瘤相关抗原(tumor-associated antigen, TAA) 是指在肿瘤细胞或正常细胞上都存在的一类抗原分子，常用于临床肿瘤的诊断。与TAA不同，新抗原（Neoantigens）是从肿瘤基因组的遗传改变中获得的突变肽，在肿瘤细胞中特异表达，在正常组织中不存在。因此利用好这种抗原我们就有希望以最小的副作用消除患者的癌症。

一 新抗原（Neoantigen）简介

新抗原是在正常组织中不存在的外来蛋白，但可以通过各种机制从肿瘤中产生，如基因组突变、异常转录变异体、翻译后修饰和病毒开放阅读框(图1a)。这些抗原可由肿瘤细胞的主要组织相容性(MHC)分子递呈。首先，新抗原由蛋白酶体介导的内源蛋白质分解产生突变多肽。随后通过与抗原处理相关的转运蛋白(Transporters associated with antigen processing，TAP)运输到内质网(endoplasmic reticulum，ER)，在内质网中它们会被加载到MHC-I上。MHC-II二聚体被组装并结合到内质网中的不变链(invariant chain，Ii)上。Ii-MHC-II复合体可以从细胞表面直接运输或有时间接内化到MHCⅡ类区室(MHC-II compartment，MIIC)中，在MIIC 中Ii被一系列内体蛋白酶降解以用于与特定多肽（内体途径中分解突变蛋白产生）结合。这些pMHC复合体随后将交通到细胞表面，在细胞表面它们被T细胞识别（图1b，c）。

图1 新抗原产生来源和抗原递呈

基于肿瘤特异性和免疫遗传学的优势，新抗原可以成为肿瘤免疫治疗的新靶点，这些肿瘤免疫治疗包括肿瘤疫苗、过继性免疫治疗(Adoptive Cell Transfer Therapy, ACT)和基于抗体的治疗以及免疫检查点阻断（Immune checkpoint blockade therapy，ICBs）的潜在预测因子。新抗原有特异性新抗原（单一癌症中特有）和共同新抗原（多种癌症中表达）。与特异性新抗原治疗相比，研究共同新抗原可以减少资源和时间的消耗。由于特异性新抗原是患者特有的，它们不能用于针对大量患者（图2）。

图2基于新抗原的治疗的分类

由于免疫检查点抑制剂(Immune checkpoint inhibitors,ICIs)治疗在癌症中的抗肿瘤活性相对较低，科研人员开始尝试联合各种治疗策略，其中基于新生抗原的免疫疗法被广泛关注。单药治疗方式不能充分解决肿瘤的异质性和适应性，耐药也会导致单药治疗疗效不佳，因此，对患者进行两联或三联治疗可能会更有效地消除肿瘤。此外，需要在治疗期间进行纵向评估以揭示某些耐药机制，并相应地调整治疗（图3）[1]。

图3 基于新抗原的治疗设计

二 免疫原性新抗原的鉴定、预测和验证

从基因组突变、异常转录变异体、翻译后修饰和病毒开放阅读框中鉴定免疫原性新抗原是开发有效免疫疗法的第一步。由于全外显子组测序(Whole Exome Sequencing，WES)、RNA-SEQ和蛋白质组测序的发展，科研人员现在可以在整个癌症谱系中筛选新抗原。但是，由于肿瘤具有广泛的异质性，特异性免疫治疗需要根据患者和肿瘤的不同特征来检测和预测新抗原。对于免疫原性新抗原的预测，需要鉴定基因组的突变以及患者主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）的相关细节，因为突变产生的肿瘤新抗原对免疫反应依赖于这几个变量：多肽的翻译和处理、MHC分子呈递突变的多肽以及pMHC复合体（指抗原肽-MHC分子复合物，位于细胞或靶细胞表面）与TCR的亲和力[2]。

体细胞突变的鉴定

通过二代测序技术（Next-Generation Sequencing，NGS）比较肿瘤和正常组织之间的基因变化，极大地帮助科研人员研究免疫基因组。目前，科研人员可以从NGS数据中可以检测出可能的新抗原。科研人员可以使用肿瘤和正常DNA的WES绘制肿瘤特异性的遗传异常。RNA-seq数据可以结合WES来确定突变基因是否在肿瘤中表达。另外，在RNA-seq中还可以发现更多隐藏的生物信息，如拷贝数变化、微生物污染、可转座元件和细胞类型等信息。RNA-seq还可用于检测可变剪接事件，并估计突变等位基因表达的相对频率。MHC结合多肽的高通量鉴定是通过免疫化学技术实现的，该技术利用MS（基于液相色谱串联质谱法）直接检测免疫沉淀和提取的MHC结合多肽。近年来，MS在预测的新抗原方面也取得了进展。此外，MS还可以与NGS联合来进一步检测由体细胞突变、非编码RNA和蛋白酶体剪接产生的肿瘤特异性新抗原

计算机预测新抗原

基于NGS数据，科研人员可以利用相关算法发现潜在的新抗原。简而言之，新抗原预测的工作流程可归纳为以下步骤:(I)突变识别；(II) HLA分型；(III)基于HLA结合亲和力的新抗原筛选和优先排序;(IV)使用基于T细胞的检测方法对免疫原性新抗原进行实验验证（图4）。

图4 新抗原预测的工作流程

候选新抗原免疫原性的评估和验证

评估一个免疫原性新抗原的关键条件是合适的MHC分子递呈和有效的TCR识别。计算机技术中识别新抗原特异性T细胞最常用的方法是NetCTL / NetCTLpan，它通过分析MHC呈递，C端切割亲和力和TAP转运（而不是直接预测T细胞结合）来生成综合评分。最近的研究使用机器学习或深度学习技术来预测TCR-肽/-pMHC结合。然而，由于TCR与pMHC配体的低亲和力，计算机预测TCR和pMHC在细胞中的亲和力仍然是具有挑战性。为了更准确地评估新抗原在免疫治疗中的可能应用，对其T细胞反应性的实验验证是至关重要的。新抗原反应性T细胞可以通过基于T细胞的分析、多色标记的MHC四聚体、酶联免疫吸附斑点(ELISpot)和T细胞图谱进行验证或筛选。

三如何利用新抗原发文章

建立数据库

随着肿瘤免疫基因组学的发展，科研人员已开发出几种用于肿瘤特异性新抗原检测的集成软件，如TSNAD和PVAC-seq。这类软件最关键的功能是预测突变多肽与人类白细胞抗原(人类白细胞抗原)等位基因之间的结合亲和力。NetMHC、NetMHCpan、sNeBula和HL A-CNN等工具可以实现这一点。此外，数据库也是一种非常重要的工具。可以为科研人员提供必要的信息，以开发工具来预测多肽和HLA等位基因之间的亲和力。例如，免疫表位数据库(IEDB)是一个重要的免疫相关数据库，提供了大量有价值的、经过实验验证的免疫表位信息。国际免疫遗传学信息系统(IMGT)提供有关抗体、TCR、MHC等的信息。其实，科研人员可以利用现有的新抗原预测软件，建立了几个与新抗原相关的数据库。随着癌症基因组学数据的快速增长，研究人员能够在肿瘤患者群体中发现潜在的共同新抗原。

在下面的文章中[3]，作者从泛癌免疫基因组学的角度开发了一个肿瘤特异性新抗原数据库(TSNAdb)。基于肿瘤基因组图谱(TCGA)的16种肿瘤类型的7748例肿瘤标本，作者预测了突变型/野生型多肽与人类白细胞抗原I类分子的结合亲和力。作者使用的数据集来自TCGA的肿瘤样本的体细胞突变数据和TCIA（The CancerImaging Archive）中对应的HLA等位基因数据。此外，作者还利用TSNAD中嵌入的相关过滤工具，对体细胞突变产生的潜在新抗原进行分析并提供了详细的信息。最后，作者还利用反复出现的错义突变结合高频率的HLA等位基因来预测和分析潜在的共有新抗原。总之，这样的研究将为寻找基于新抗原的癌症免疫治疗的靶点提供了一个平台（图5）。

图5 TSNAdb Web界面的概述

新抗原可作为免疫治疗的潜在生物标志物

生物标志物通常是指能被客观测量和评价，反映生理或病理过程，以及对暴露或治疗干预措施产生生物学效应的指标。新抗原在肿瘤免疫治疗中提供了一个突破口，但是免疫治疗只有一部分患者反应良好。很少有生物标志物来衡量肿瘤患者对新抗原的免疫反应和预测患者的预后。新抗原是一类在肿瘤细胞中异常表达的短肽，它是由体细胞突变引起的，被用作肿瘤特异性抗原。其中，新抗原可以与人类白细胞抗原(人类白细胞抗原)分子结合并呈现在表面，从而被T细胞受体(TCR)识别为非自我，从而引发T细胞介导的抗肿瘤免疫反应。科研人员可以利用新抗原可作为免疫治疗的潜在生物标志物，帮助临床医生进行受试者分层、人群富集和排除临床不获益患者。

下文中[4]，作者的团队开发了一个定制的新抗原预测工作流程。作者首次构建了基于新抗原载量、细胞溶解评分和人类白细胞抗原-I评分的新抗原免疫反应评分(NAIR评分)系统。NAIR评分可以评估对肿瘤新抗原的免疫反应的水平，其中高NAIR评分是与OS增加的有效的生物标志物（图6）。

图6 高和低NAIR得分组之间的分子特征

新抗原与mRNA疫苗研

新抗原疫苗是刺激、增强和多样化抗肿瘤T细胞反应的有效方法。各种形式的新抗原疫苗，如肽、核酸和树突状细胞（DCs）疫苗，正在对不同类型肿瘤患者的临床试验进行评估。目前全球各类新抗原肿瘤疫苗研究中，多肽形式占比最大，原因是多肽最直接、成药性以及安全性相对较好、基础数据多；不过多肽也有缺点，就是不同序列多肽的理化性质差异较大，工艺路线和质量标准研究的难度较大。相比于多肽疫苗，DNA/RNA疫苗不受HLA限制，并且能够同时刺激细胞免疫与体液免疫，增强免疫反应。DC是专业的抗原呈递细胞 （APC），负责将抗原摄取、加工和呈递到T细胞以激活免疫反应。DC肿瘤疫苗的优势表现在新抗原的负载在体外进行，影响因素相对较少。

在下面的研究中[5]，作者的目的是鉴定肝细胞癌(liver hepatocellular carcinoma,LIHC)新抗原，以开发mRNA疫苗，并确定LIHC免疫图谱，以便于选择合适的患者接种疫苗。在LIHC中发现了两个高表达的突变基因（KPNA2和POLR3C），这两个基因与低生存期和抗原呈递细胞（Antigen-presenting cells, APC）浸润状态相关。同时，通过对TCGA队列中免疫相关基因进行聚类分析，并在独立的ICGC队列中进行了验证。随后，作者根据相关遗传特征的分布，确定了LIHC在个体中的免疫格局。结果表明，作者的研究成果有助于发展mRNAs疫苗和筛选合适的接种患者（图7）。

图7 LIHC潜在肿瘤抗原的鉴定

全文总结

肿瘤新抗原（Neoantigens），拥有的独特氨基酸序列，患者之间极少出现完全相同的新抗原，通过二代测序或肽库筛选可以进行准确检测。正因为仅在肿瘤组织表达的特性，靶向新抗原的免疫治疗在临床试验中对正常组织基本不会产生毒性。同时，与新抗原具有高亲和力TCRs的T细胞不受胸腺选择的影响，而更容易分离获得。理解新抗原诱导的抗肿瘤免疫应答机制以及简化基于新抗原的免疫治疗过程将有助于肿瘤治疗的发展。

参考文献：

[1]Lybaert L, Lefever S, Fant B, et al. Challenges in neoantigen-directed therapeutics [J]. Cancer Cell, 2023, 41(1): 15-40.

[2]Xie N, Shen G, Gao W, et al. Neoantigens: promising targets for cancer therapy [J]. Signal Transduct Target Ther, 2023, 8(1): 9.

[3]Wu J, Zhao W, Zhou B, et al. TSNAdb: A Database for Tumor-specific Neoantigens from Immunogenomics Data Analysis [J]. Genomics Proteomics Bioinformatics, 2018, 16(4): 276-82.

[4]Jian X, Xu L, Zhao J, et al. NAIRscore as a biomarker for the quality of immune response to neoantigens is related with an increased overall survival in multiple myeloma [J]. Mol Ther Nucleic Acids, 2022, 29: 285-95.

[5]Li Y F, Hou Q Q, Zhao S, et al. Identification of tumor-specific neoantigens and immune clusters of hepatocellular carcinoma for mRNA vaccine development [J]. J Cancer Res Clin Oncol, 2023, 149(2): 623-37.

来源： 生物制品圈 2023-04-16

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